1、適用范圍

適用于《2020版中國藥典一部》中蜂蜜中寡糖的鑒定。

2、測試原理

試樣中的高分子糖，經活性炭-硅藻土柱的富集、濃縮，再用薄層色譜法分離、檢測。經過與摻有一定含量的麥芽五糖的純蜂蜜比較，來判定蜂蜜中寡糖的存在。

3、所需耗材和試劑

標準品： 純蜂蜜、麥芽五糖

樣品：陽性蜂蜜

試劑： 乙醇(分析純)、正丁醇(分析純)、乙酸(分析純)、二苯胺(CAS: 537-67-7)、丙酮(分析純)、苯胺、磷酸(優級純)、超純水。

薄層板：硅膠G板200mm×200mm，膜厚0.25mm。使用前應畫板，畫板方法為下端留2cm，薄層板的寬度為2.5cm，從下端處向上量3.5cm位置畫線，此線為Rf值，從下端2cm處向上量10cm位置畫線，此為爬板終點線，爬過此線視為爬板過程結束。畫好板后需要在110 ℃恒溫干燥箱中活化1h后，置于干燥器中放冷至室溫，備用。

固相萃取柱：月旭Welchrom® HON蜂蜜專用柱，規格：500mg/12mL

4、實驗步驟

4.1 SPE 前處理步驟

活化：25mL水，過柱流速1滴/秒；

上樣：在50mL燒杯中稱取2g試樣，精確到1mg，溶于10mL水后，緩慢加到月旭Welchrom® HON蜂蜜專用柱上；

淋洗：25mL 7%乙醇水；

洗脫：10mL 50%乙醇水，收集洗脫液；

濃縮及復溶：收集的洗脫液置于65℃水浴中減壓濃縮至干，殘渣加入30%乙醇1mL使之溶解，作為供試品溶液。(溶解時候要注意確保殘渣*復溶)；

麥芽五糖標準溶液的配置：取麥芽五糖對照品，加30%乙醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。

注：

1) 整個SPE過小柱的前處理過程都需要用固相萃取真空裝置，抽取一定的真空度以確保液體能夠滴出小柱；

2) 旋蒸濃縮的時候應使用盡可能小體積的茄形瓶，推薦用25mL規格，以防止復溶的時候因接觸面積過大而損失樣品；可以少量多次地添加溶劑進行復溶；

3) 用超純水活化小柱時，注意在液面下降至

小柱填料上端時，即可添加樣品溶液上樣，切記活化過程中不能將液面抽干，否則會影響小柱對寡糖的保留效果。

4.2  點板條件

TLC板：薄層色譜用硅膠板(涂層厚度0.2-0.25mm)

展開劑：正丙醇:水:三乙胺=60:30:0.7

顯色劑：稱取1.0g二苯胺鹽酸鹽置于盛有50.0mL丙酮的燒杯中，再加入1mL苯胺，混合攪拌，同時加入5mL 85%的磷酸，此時會有白色絮狀物出現，*溶解后可以使用，此顯色劑要現用現配，各種試劑要按照以上順序添加。

注：

顯色劑的添加順序一定要按照順序添加，不可顛倒。

4.3 具體點板過程

用10µL微量注射器在距離薄層板下端2cm的位置，點上3.0µL的樣液，同時另取一塊薄層板，點上同樣量經過同樣處理的純蜂蜜和麥芽五糖標準溶液作為對照。點樣時點越小、越集中爬板效果就越好。然后將其放置在展開槽中(在展開劑中進行展開，使用250mL的廣口瓶作為展開缸，加入10mL展開劑即可)，待爬板結束后(一次跑板的時間大約需用時2.5h)，用吹風機將薄層板吹干后，均勻噴涂顯色劑，再次吹干后，放置到110℃的烘箱中烘烤20-30min（烘烤至顯色），觀察顯色后的TLC板的效果。

5、實驗結果與判斷標準

從恒溫干燥箱中取出薄層板，觀察TLC板的顯色情況，純蜂蜜只在Rf值0.35以上的區域有2~3個藍色中帶灰色或咖啡色的斑點，相比較麥芽五糖或混有麥芽五糖的蜂蜜卻是從原點開始呈現藍色帶狀樣的斑點群。